帕金森病嚙齒類動物模型的制備方法

一、通過耗竭單胺類神經(jīng)遞質(zhì)制作PD模型

(一)利血平模型

利血平是一種生物堿。通過不可逆地封閉囊內(nèi)單胺運輸消耗中樞和外周單胺，從而影響細胞內(nèi)囊泡的單胺再循環(huán)，于20世紀50年代被用于制作大鼠PD模型。當嚙齒類動物注射利血平后，囊內(nèi)攝取的DA、5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NA)被封閉，在胞質(zhì)內(nèi)被降解，快速降低單胺水平，導致肌肉僵硬等PD的癥狀。

制備方法：應用雄性Wistar大鼠，腹腔內(nèi)注射一定劑量的利血平后即可使其出現(xiàn)骨骼肌僵硬、震顫、姿勢異常。該模型制作方法簡單。其對人類大的貢獻在于揭示出左旋多巴(L-DOPA)可作為治療PD的潛在藥物。缺點是只能短暫模擬PD的癥狀，不能*復制自發(fā)性PD的病理變化。

(二)甲丨基丨苯丨丙丨胺模型

苯丨丙丨胺丨類藥物是一類具有潛在成癮性的神經(jīng)興丨奮丨劑，具有促DA釋放作用，大劑量應用對嚙齒類動物和非人類的靈長類動物具有神經(jīng)毒性，像利血平一樣，它能夠?qū)е翫A能神經(jīng)元末梢DA的耗竭，對黑質(zhì)神經(jīng)元損傷作用較小。Boirean等研究表明，該藥可通過DA轉運體被攝入細胞內(nèi)，興奮性氨基酸受體拮抗劑MK.801可阻斷其毒性作用，體外實驗提示能量代謝障礙、氧化應激和興奮性氨基酸均與其毒性作用有關。制作方法：用成年大鼠，按體重10～25mg/kg皮下注射甲丨基丨苯丨丙丨胺，每天一次，連續(xù)4天。用藥后可出現(xiàn)短暫活動過多，隨之是活動減少。4～5d后可有“幻覺樣”行為，表現(xiàn)為顫抖、舔毛、咬皮毛。1周后檢測即可發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)和紋狀體中酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)活性降低，DA含量減少，但黑質(zhì) DA能神經(jīng)元丟失不明顯。該模型制作方法簡單，是一個急性損傷模型，癥狀的持續(xù)時間及穩(wěn)定性方面尚不理想，也無PD的特征性組織病理學改變。主要用于研究PD多巴胺耗竭后的紋狀體生理、生化學改變，也可用于神經(jīng)保護方面的研究。

二、神經(jīng)毒素制作PD模型

對PD患者大腦的研究顯示，在氧化應激過程中存在線粒體復合物Ⅰ功能的抑制，因而這可能是黑質(zhì)DA神經(jīng)退行性變的重要組成部分。對MPTP、6-羥基多巴胺(6-OHDA)和羅藤酮的研究已經(jīng)為探索多巴胺神經(jīng)元死亡的分子機制提供了希望。

MPTP是1982年在一組藥物成癮所致的亞急性重癥帕金森病患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。這種癥狀是由于這些人自己服用一些含有與人工合成的嗎啡結構相似的藥物所致。而這種藥物被加工過程中的一些副產(chǎn)物MPTP所污染，這種副產(chǎn)物有高親脂性并且能夠通過血腦屏障。膠質(zhì)細胞內(nèi)的單胺氧化酶能將MPTP轉化成1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)，后者可以被DA轉運體所攝取并在DA神經(jīng)元內(nèi)堆積。缺乏這種轉運體的小鼠能避免MPTP的毒性損害。吸收的MPP+在線粒體內(nèi)富集，它們能夠抑制線粒體電子傳遞鏈中復合物Ⅰ的功能，從而使 ATP的生成減少并且產(chǎn)生活性氧自由基誘導DA神經(jīng)元的凋亡。有趣的是，MPTP甚至能使具有中央神經(jīng)系統(tǒng)的一些低級的無脊椎動物如扁形蟲、三渦蟲神經(jīng)元死亡。這提示 MPTP對無脊椎動物和靈長類動物都具有神經(jīng)毒性。故在靈長類動物，如人、猴、狒狒中， MPTP能引起不可逆的嚴重的帕金森病癥狀，這種癥狀與散發(fā)的PD不能區(qū)別。這其中包括黑質(zhì)DA神經(jīng)元的變性，微包涵體的出現(xiàn)[如嗜伊紅性包涵體和α-synuclein的聚合體(并不是典型的Lewy體)]，在電鏡下觀察，這些微包涵體由一個高密度的粒狀核心和圍繞其周圍的放射狀細絲暈組成。對靈長類動物予以MPTP處理后其顯示出對左旋多巴(L-3，4二羥基多巴)及其他DA受體激動劑較好的應答。然而，采用MPTP毒素制作PD模型的主要缺點是PD是一種慢性發(fā)展的疾病，而MPTP所致的是急性或亞急性的發(fā)病過程。在靈長類動物中采用不同的劑量水平慢性給予MPTP已經(jīng)顯示能夠產(chǎn)生緩慢發(fā)展的帕金森病癥狀，在紋狀體中多巴胺纖維的損失不均勻，并且顯示出在黑質(zhì)部位DA神經(jīng)元的選擇性損耗。

6-OHDA是用來制作帕金森病動物模型的另一種藥物。常用的方法是單側注射6- OHDA至黑質(zhì)或者中央前腦束，這可以使DA神經(jīng)元細胞在較短的時間內(nèi)快速死亡。這與急性MPTP模型相似。另外一種6-OHDA模型直接注射這種毒素到紋狀體內(nèi)而導致黑質(zhì)神經(jīng)元的退行性變。這種方法可以在4周內(nèi)緩慢地損傷部分神經(jīng)元，因而已經(jīng)被用來模擬PD的慢性病程。

在向黑質(zhì)注射6-OHDA之后，這些藥物選擇性地積聚在DA神經(jīng)元，并對其產(chǎn)生毒性作用。這一過程可能是通過產(chǎn)生自由基而完成的。6-OHDA對大鼠、小鼠、貓及靈長類動物是一種的毒物，并且被廣泛用來制作單側損傷模型。在大鼠中廣泛的DA損耗可以通過對給予安丨非丨他丨明和脫水嗎啡引起的旋轉活動來進行評估。這種模型主要的優(yōu)點是可以計量運動減少(旋轉)，因而這一模型被證實在藥理學研究中用來觀察藥物對多巴胺及其受體是否有效是非常有用的。

羅藤酮是一種天然的殺蟲劑，其起源于某些特殊植物的根部，并且是一種線粒體復合物Ⅰ的高親和力特異性抑制劑。Betarbet等證實大鼠通過頸靜脈叢插管長期、系統(tǒng)地給予羅藤酮可以產(chǎn)生許多PD的特征，包括黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的變性和DA神經(jīng)元內(nèi) Lewy體的形成。這些包涵體可以被泛肽和α-synuclein抗體所染色，電鏡下觀察，高密度的核心被纖維狀物質(zhì)環(huán)繞，這與Lewy體的結構非常相似。實驗大鼠出現(xiàn)運動徐緩、姿態(tài)不穩(wěn)、步態(tài)不穩(wěn)及一些震顫的跡象，這些癥狀在給予DA受體激動劑脫水嗎啡后得以改善，提示這種緩慢的羅藤酮給藥法是一個較好的改進的簡單給藥法。

在大鼠黑質(zhì)內(nèi)單獨注射MPP+、6-OHDA和羅藤酮引起不同的運動功能抑制。MPP+、6-OHDA和羅藤酮是多巴胺能的神經(jīng)毒素，但是這些毒素對大鼠腦組織毒性作用的機制仍然不是很清楚，需要進一步深入研究。